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국내 승인 LM면화의 자연환경 모니터링을 위한 multiplex PCR 개발

Multiplex PCR method for environmental monitoring of approved LM cotton events in Korea

신수영|송해룡|김일룡|이중로|최원균|설민아|엄순재|조범호
한국식물생명공학회 (Korean Society for Plant Biotechnology)|2016.03|Journal of Plant Biotechnology|제43권 제1호|pp. 91-98

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EventDetectionCottonLMOMultiplex PCR
주제분류농학

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면화(cotton)는 섬유를 수확하고, 면실유는 식용으로 가공후 남은 것은 다시 사료로 이용되어 다방면으로 다양하게 활용되는 작물이다. LM 면화는 옥수수, 대두, 캐놀라와 달리 아시아권(중국, 인도 등)에서 가장 많이 재배되고 있으며, 우리나라는 2013년까지 세계 1위의 LM 면실(사료용) 수입국이며, 세계 4위의 면실박 수입국으로 해마다 증가하는 LM 면화의 수입량과 맞물려 유통 및 소비과정에서의 비의도적으로 유출 가능성이 증가함에 따라 LM 면화의 자연생태계 위해성 평가 및 안전관리가요구된다. 본 연구에서는 국내 수입· 승인 LM 면화 6개이벤트(MON15985, MON531, GHB614, LLCOTTON25, MON 88913, MON1445)의 동시증폭 검출법(multiplex PCR)을 개발하여 보다 신속하고 명확한 검출기법을 확립하고자 하였다. 최적 multiplex PCR 반응 조건은 2개 LM 면화 이벤트 MON15985 (214 bp), MON531 (270 bp)와 4개 LM 면화이벤트 GHB614 (119 bp), LLCOTTON25 (164 bp), MON 88913 (276 bp), MON1445 (389 bp)가 한번의 반응에 명확하게 검출되는 최적 반응 조건 및 primer 반응 농도의 조절을 통해 서로 다른 생성물 크기로 명확히 구분되도록하였고, 최적 primer 농도는 반응액 최종농도 0.2 ~ 0.66 pmol로 primer 쌍 마다 각각 다른 최적 농도 조합의cocktail 을 만들어 활용하였다. Duplex PCR 반응 조건은 초기 95°C 5분 반응 후, 95°C 15초, 55°C 20초 15회 반응하고, 다시95°C 15초, 60°C 20초 25회 반응하였을 때 최적 검출이 이루어졌고, tetraplex PCR 반응 조건은 95°C 5분 반응 후, 95°C 15초, 60°C 20초 50회 반응하였을 때 최적 검출이 이루어졌다. 본 연구에서 개발된 multiplex PCR 검출법은 국내 수입·유통 LM 면화의 자연환경 모니터링에 활용함에있어 요구되는 연구인력, 시간 및 비용을 보다 효율적으로 개선하는데 적용될 수 있을 것으로 사료된다.

Abstract

The growth area of living modified (LM) cotton has steadily increased every year, since its first commercialization in 1996. Development of environmental risk assessment tools and techniques for LM cotton is required for ecosystem safety. We therefore developed multiplex PCR assays for simultaneous detection of two (MON15985, MON531) and four (GHB614, LLCOTTON25, MON88913 and MON1445) LM cotton events approved in Korea, with event specific primer pairs. The PCR reactions were optimized by using event specific primers of six LM cottons at various concentrations. The reactions allows amplification of estimated amplicons of MON15985 (214 bp), MON531 (270 bp), GHB614 (119 bp), LLCOTTON25 (164 bp), MON88913 (276 bp), and MON1445 (389 bp) from multiplex PCR reactions. The multiplex PCR assay developed allowed that two annealing steps (15 cycles at 55°C and 25 cycles at 60°C) were performed for amplification of distinguished two LM cottons, and only one annealing step (50 cycles at 60°C) was necessary for tetraplex PCR. Primer extension step of all PCR reactions was skipped for time-effective amplification. Our methods suggest that two multiplex PCR assays can be cost-effective and a rapid diagnostic tool for environmental LMO monitoring of six LM cottons.

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