미세주입된 소 수정란에서 유전자적중 효율 및 배반포 품질 확인
Determination of Gene Target Efficiency and Blastocyst Quality in Microinjected Bovine Embryos
0
조회
0
다운로드
1
인용
0
참고문헌
키워드
초록
형질전환 동물 생산에 있어서 타깃 유전자의 적중 기술에 의한 유전자 편집 수정란의 생산 효율이 매우 낮으며, 유전자 적중 여부 확인, 분석 및 품질 개선 등과 같은 연구가 필요하다. 따라서 본 연구에서는 유전자 편집 수정란의 지속적인 생산을 위한 미세주입 기술 조건 구축과 유전자 적중 효율 개선 등에 대한 실험을 수행하였다. 우선적으로 타깃 유전자 도입을 위한 미세주입기술에서 사용되고 있는 유전자 편집 기술인 CRISPR/Cas9 시스템의 nuclease을 Cas9 protein과 mRNA 두 군으로 나누어 실험을 수행하였다. 미세주입된 배반포들의 GFP 발현 및 유전자 적중율을 확인해 본 결과, Cas9 protein을 사용한 군에서 그 효율이 mRNA를 사용한 군보다 높게 나타남을 확인할 수 있었다. 다음으로 미세주입과정에서 세포막에 발생되는 물리적 손상을 줄여준다고 알려진 cytochalasin B(CB)가 첨가된 용액에서 수정란에 미세주입을 실시한 후 배반포 단계까지 발달율을 조사하였다. 그 결과, CB를 첨가한 수정란에서 배반포 발달율(18.5±2.0%)이 CB를 첨가하지 않은 대조구(13.1±1.6%) 보다 유의적으로 증가하였다(p<0.05). 이후, 수정란의 배반포로의 발달과 품질 향상에 도움을 준다고 알려진 멜라토닌을 이용하여 CB 처리하에 미세주입된 수정란의 체외배양을 실시하였다. 예상대로, 멜라토닌을 첨가한 그룹에서 배반포 발달율(23.8±4.9%)이 멜라토닌을 첨가하지 않은 대조구(18.2±2.2%) 보다 유의적으로 증가하였다(p<0.05). 또한, 미세주입된 배반포를 대상으로 DNA 손상 단백질인 H2AX139ph와 DNA 복구 단백질인 RAD51을 이용하여 면역형광염색법을 진행한 결과, 멜라토닌을 첨가한 그룹에서 RAD51의 양성 세포수가 증가함을 확인하였다. 결론적으로 본 연구결과는 타깃 유전자 도입을 위한 효율적인 미세주입 조건과 높은 품질의 배반포 생산 체계를 구축함으로써 유전자 편집 수정란의 지속적이고 안정적인 생산과 형질전환 동물 생산에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
Abstract
This study aimed to produce high-quality blastocysts and establish appropriate microinjection conditions for the introduction of target gene. First, we identified embryo development to the blastocyst stage after microinjection using the CRISPR/Cas9 system on the Cas9 protein or mRNA. As a result, we confirmed that blastocyst development in the Cas9 mRNA injected group significantly increased when compared to the Cas9 protein injected group (p<0.05). However, the blastocyst gene targeting rate increased in the Cas9 protein injected group when compared to the Cas9 mRNA injected group (p<0.05). Next, we treated the injection medium with 10 µg/ml of cytochalasin B (CB), and the microinjected embryos were cultured in CR1-aa medium supplemented with 0.1 µM of melatonin (Mela). Consequently, the blastocyst formation rate significantly increased in the CB treated group (p<0.05). After microinjecting embryos with the CB treated injection medium, we investigated blastocyst formation and quality via Mela treatment. Consequently, the Mela treated group demonstrated significantly increased blastocyst formation rates when compared to the non-treated group (p<0.05). Furthermore, immunofluorescence assay using RAD51 (DNA repair detection protein) and H2AX139ph (DNA damage detection protein) showed an increase in RAD51 positive cells in Mela treated embryos. Therefore, we verified the improvement in knock-in efficiency in microinjected bovine embryos using Cas9 protein. These results also demonstrated that the positive effect of the CB and Mela treatments improved the embryonic developmental competence and blastocyst qualities in genetically-edited bovine embryos.
참고문헌 (25)
- Bohrer, R. C., "The incidence of DNA double-strand breaks is higher in late-cleaving and less developmentally competent porcine embryos", Biol. Reprod., 93(3), pp.59~ (2015)
- Clark, A. J., "Gene targeting in livestock: a preview", Transgenic Res., 9(4-5), pp.263~275 (2000)[DOI]
- Crispo, M., "Efficient Generation of Myostatin Knock-Out Sheep Using CRISPR", Cas9 Technology and Microinjection into Zygotes, 2015, pp.10(8), e0136690~
- Fujihira, T., "Developmental capacity of vitrified immature porcine oocytes following ICSI: effects of cytochalasin B and cryoprotectants", Cryobiology, 49(3), pp.286~290 (2004)[DOI]
- Hai, T., "One-step generation of knockout pigs by zygote injection of CRISPR", Cas system, 2014, pp.24(3), 372~375
- Hisano, Y., "Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR", Cas9 system in zebrafish, 2015, pp.5, 8841~
- Ishizuka, B., "The effect of melatonin on in vitro fertilization and embryo development in mice", J. Pineal. Res., 28(1), pp.48~51 (2000)[DOI]
- Johnson, R. D., "Double-strandbreak-induced homologous recombination in mammalian cells", Biochem. Soc. Trans., 29, pp.196~201 (2001)[DOI]
- Kang, J. T., "Effects of melatonin on in vitro maturation of porcine oocyte and expression of melatonin receptor RNA in cumulus and granulosa cells", J. Pineal. Res., 46(1), pp.22~28 (2009)[DOI]
- Li, Y., "Melatonin protects porcine oocyte in vitro maturation from heat stress", J. Pineal Res., 59(3), pp.365~375 (2015)[DOI]
- Liu, J., "Effects of interval between fusion and activation, cytochalasin B treatment, and number of transferred embryos, on cloning efficiency in goats", Theriogenology, 76(6), pp.1076~1083 (2011)[DOI]
- Liu, R., "Melatonin enhances DNA repair capacity possibly by affecting genes involved in DNA damage responsive pathways", BMC Cell Biol., 14, pp.1~ (2013)[DOI]
- Maga, E. A., "Increased efficiency of transgenic livestock production", Transgenic Res., 12(4), pp.485~496 (2003)[DOI]
- Monzani, P. S., "Transgenic bovine as bioreactors: Challenges and perspectives", Bioengineered, 7(3), pp.123~131 (2016)[DOI]
- Murakami, M., "Fluorescence expression by bovine embryos after pronuclear microinjection with the EGFP gene", J. Vet. Med. Sci., 61(7), pp.843~847 (1999)[DOI]
- Ni, W., "Efficient gene knockout in goats using CRISPR", Cas9 system, 2014, pp.9(9), e106718~
- Pinkert, C. A., "Genetic engineering and competitiveness of livestock production", Agriculturae Conspectus Scientificus (ACS), 68(2), pp.45~54 (2003)
- Robl, J. M., "Transgenic animal production and animal biotechnology", Theriogenology, 67(1), pp.127~133 (2007)[DOI]
- Shi, J. M., "Melatonin exists in porcine follicular fluid and improves in vitro maturation and parthenogenetic development of porcine oocytes", J. Pineal. Res., 47(4), pp.318~323 (2009)[DOI]
- Song, J., "RS-1 enhances CRISPR", Cas9- and TALEN-mediated knock-in efficiency, 2016, pp.7, 10548~
- Su, J., "Melatonin significantly improves the developmental competence of bovine somatic cell nuclear transfer embryos", J. Pineal. Res., 59(4), pp.455~468 (2015)[DOI]
- Takada, L., "Effect of melatonin on DNA damage of bovine cumulus cells during in vitro maturation (IVM) and on in vitro embryo development", Res. Vet. Sci., 92(1), pp.124~127 (2012)[DOI]
- Tian, X., "Melatonin Promotes the In Vitro Development of Microinjected Pronuclear Mouse Embryos via Its Anti-Oxidative and Anti-Apoptotic Effects", Int J. Mol. Sci., 18(5), pp.988~ (2017)[DOI]
- Yang, H., "Generating genetically modified mice using CRISPR", Cas-mediated genome engineering, 2014, pp.9(8), 1956~1968
- Yoshimi, K., "ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes", Nat. Commun., 7, pp.10431~ (2016)[DOI]