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인간 배아 피부 섬유 모세포에서 Matrix Metalloproteinase 2와 9의 발현에 대한 HPV 16 E6 단백질의 역할

The Role of HPV16 E6 Protein on Matrix Metalloproteinase 2 and 9 Expressions in Human Embryo Skin Fibroblast Cell

강재성|신진우
대한산부인과학회 (Korean Soceity of Obstetrics and Gynecology)|2005.10|Obstetrics & Gynecology Science|제48권 제10호|pp. 2336-2344

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MMP자궁경부암HPVCarcinogenesis인유두종바이러스Cervical carcinoma종양단백질
주제분류산부인과학

초록

목적: 종양의 침윤과 전이에 관여하는 MMP 2와 9의 과발현에 인유두종 바이러스 16의 대표적인 종양유발 단백질인 E6의 역할에 대해, 인간 태아 피부 섬유 모세포에서 알아보고자 한다. 연구 방법: E6 단백질의 ORF (open reading frame)는 HPV 16의 DNA가 세포 유전자로의 융합이 확인된 CaSki 세포주에서 PCR하여 얻었으며, 인간 세포에서 DNA를 발현시킬 수 있는 pTARGET에 클로닝을 하였다. 음성 대조 플라스미드는 pTARGET로 self-ligation을 유도하여 구성하였다. 이를 JM109에 형질전환하여, 색깔 선별하고 플라스미드를 분리하였다. 각 플라스미드의 구성의 정확성은 제한 효소 처리하여 확인하였다. 이를 인간 태아 피부 섬유 모세포주에 transfection하고 세포배양액을 취하여 zymogram을 시행하였다. 젤을 건조한 후 LabWork 4.0을 이용하여 MMP 2와 9의 활성을 측정하였다. 결과: Zymogram 시행 후 gelanolytic 활성도는 푸른 바탕 젤의 흰색 밴드의 밀도로 측정하였는데, 대조군의 밀도를 100으로 고정하고 실험군의 밀도를 상대비율로 측정하였다. MMP 2에서는 실험군이 대조군보다 zymogen (72 kDa)과 active form (67 kDa)이 각각 10.5%과 36.3%의 활성 증가를 보였다. 그러나 MMP 9에서는 실험군이 대조군보다 0.21%의 활성감소를 보였다. 결론: HPV 16 E6 단백질은 MMP 2의 과발현에 관여하는 것으로 사료된다.

Abstract

Objective: The purpose of this study was to evaluate the role of HPV16 E6 protein on the expressions of MMP 2 and 9, major proteins associated with tumor invasion and metastasis, in human embryo skin fibroblast cell. Methods: HPV16 E6 ORF was obtained by PCR from CaSki cell genomic DNA and was cloned into mammalian expression vector, pTARGET. Negative control vector was constructed with self ligated pTARGET. After confirmation of plasmid with color selection and restriction enzyme digestion, pTARGET-E6 and negative control vector were transfected into Detroit 551. On post-transfection third day, supernatant of both transfected cell were harvested and quantitative analysis was carried out with bradford method. Zymographic analyses were run in parallel. Areas of gelatinolytic activity were detected as clear bands on blue background and analyzed with computerized program. Results: Zymogram followed by densitometric analysis was revealed the increased expression of MMP 2 zymogen (72 kDa) and active form (67 kDa) by 10.5% and 36.3%, respectively. On the contrary, MMP 9 expression was decreased by 0.21% on densitometric analysis. Conclusion: HPV16 E6 protein has influenced on MMP 2 over-expression.

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