HT-3 자궁경부암 세포주에서 새로운 광감작제인 9-Hydroxypheophorbide-a와 670 nm 다이오드 레이저를 이용한 광역학치료의 in vivo 연구
In vivo study of photodynamic therapy using a new photosensitizer, 9-hydroxypheophorbide-a and 670 nm diode laser on HT-3 cervical cancer cell
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목적: 국내에서 개발된 광감작제로 녹조류인 Spirulina platensis에서 추출하여 만든 광감작제 9-hydroxypheophorbide-a (9-HpbD-a)를 이용하여 자궁경부암 세포주인 HT-3에서 새로 개발된 9-HpbD-a 광감작제의 임상적용을 위하여 국내에서 개발된 670 ㎚의 다이오드 레이저를 이용한 광역학치료의 항암효과 및 치료기전을 확인하고자 본 연구를 시행하였다. 연구 방법: 광감작제는 금호 생명과학연구소에서 녹조류의 클로로필을 산화반응과 산 처리를 통해 10-hydroxypheophytin-a 유도체로 만든 다음 이를 유기용매를 이용하여 추출한 10-hydroxypheophytin과 10-hydroxypheophytin-a 유도체를 유기합성 후 안정된 구조 및 대량 수율이 가능한 9-hydroxypheophorbide-a (9-HpbD-a)를 사용하였다. 세포주는 인체의 자궁경부 편평세포암주 (squamous cervical cancer cell)인 HT-3을 사용하였다 (ATCC® Number : HTB-32TM). 암세포가 이종 이식된 누드마우스 모델 (in vivo)에서 광역학치료를 시행하여 항암효과를 확인하였다. 누드마우스에 이종 이식된 종양의 크기가 약 400~500 ㎣에 도달하였을 때, 제1군 (n=5)은 정상 대조군으로 하였고, 제2군 (n=10)은 9-HpbD-a 으로만 처치한 군으로서 9-HpbD-a (9.38 mg/kg)를 DPBS 용액으로 희석하여 누드마우스의 꼬리정맥에 100 μL 투여하였다 (fanning technique). 제3군 (n=10)은 레이저 치료만을 시행한 군으로서 다이오드 레이저의 barefiber tip을 이용하여 총 500 mW의 에너지를 종양의 상방과 종양을 중심으로 4방향에서 각각 15분간 조사하였다. 제4군 (n=20)은 제2군에서 시행한 방법으로 9-HpbD-a를 종양 내에 투여하고 제 3군에서와 같이 총 500 mW의 에너지를 종양에 레이저를 조사한 광역학치료군이다. 레이저 조사 시에는 온도센서를 이용하여 종양 내의 온도변화를 기록하였다. 결과: HT-3 세포가 이종 이식된 누드마우스 모델에서 광역학치료는 아무른 처치를 하지 않은 정상대조군인 제1군, 9-HpbD-a만을 누드마우스에 투여한 제2군 그리고 670 nm 다이오드 레이저만을 종양조직에 조사한 제3군 모두에서 종양조직이 지속적으로 성장 하였다 (100%). 제 4군인 광역학치료 군에서는 총 20마리의 누드마우스에서 15마리는 완치 (75％), 3마리는 재발 (15％), 2마리는 치유되지 않았음 (10％)을 확인하였다. 광역학치료 후 정상조직, 아무른 처치를 하지 않은 HT-3 세포주 종양 조직, 광역학치료 과정인 종양조직 및 완치된 종양조직을 광학현미경으로 비교 관찰하였는데 H&E염색에서 종양조직은 전형적인 편평상피암종임을 확인하였고 광역학치료 중인 조직에서는 전체적인 크기만 줄어들었지 암세포의 형태학적 변화를 보이지는 않았다. 또한 이들 조직에서 p53 과 Ki-67의 발현정도를 비교하여 광역학치료의 예후인자로서 의의가 있는지를 보고자 하였는데 정상조직과 광역학치료로 완치된 조직에서는 p53과 Ki-67의 발현이 관찰되지 않았으며, 이종이식된 종양조직과 치료 중인 조직에서의 p53과 Ki-67의 과발현이 관찰되었고 두 군간의 발현정도는 차이가 없었다. 결론: 본 연구에서 이용한 9-HpbD-a가 기존에 사용하고 있는 1세대 광감작제를 대신하여 효과적인 광감작제로 사용되기 위해서는 종양조직에만 많은 양의 광감작제가 선택적으로 축적되게 하여 광역학치료의 효과를 높여야 하며, 9-HpbD-a의 독성능 시험을 비롯하여 현재 사용 중인 항암제와의 병합요법에 대한 연구 및 9-HpbD-a를 이용한 광역학진단 (photodynamic diagnosis) 연구를 토대로 새로운 광감작제와 함께 인체 조직의 침투력이 좋은 우수한 레이저의 개발도 함께 이루어져야 할 것으로 사료된다.
Abstract
Objective: During the last several years, such as Photofrin®, Photogem®, HpD, and 5-aminolevulenic acid (ALA) has been used as photosensitizers for a wide range of malignant tumors as well as non-malignant disease. A new photosensitizer, 9-Hydroxypheophorbide-a (9-HpbD-a) was derived from Spirulina platensis. The aim of this study was to evaluate the anticancer effect and mechanism of photodynamic therapy in vivo using 9-HpbD-a and 670 nm diode laser on a HT-3 cervical cancer cell line. Methods: PDT effects were observed in xenograft nude mouse model. HT-3 cell line was xenografted into the subcutaneous space of the mouse back. When the tumors grew up to 400~500 ㎣, the animals were randomly separated into 4 groups: Group I (n=5), control group; group II (n=10), 9-HpbD-a alone; group III (n=10), laser irradiation alone; and group IV (n=20), PDT in nude mouse group. Results: PDT treated group (9-HpbD-a+laser irradiation) showed complete response (15/20, 75%), recurrence (3/20, 15%) or no response (2/20, 10%). PDT group showed significant remission rate, comparing to laser irradiation alone group, 9-HpbD-a alone group and untreated control group (P＜0.05). When PDT using 9-HpbD-a, tumor size was decrease and microscopically finding, antitumor effect was showed inflammation and necrosis of tumor cell. Overexpression of p53 and Ki-67 gene had been detected at the HT-3 cervical cancer cell and 10 days after PDT. And no experssion in normal tissue and tumor after PDT. So, immunohistochemical study of p53 and Ki-67 gene correlated with PDT for anticancer effect. Conclusion: These results suggest that 9-HpbD-a is one of the promising photosensitizers for the future and would be needed to use 9-HpbD-a as a photosensitizer in clinical setting. We would further suggest that photodynamic therapy is a more effective method than the conventional treatment for women who want to maintain their anatomical and functional uterine cervix.
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