온도조건부 SV40 T항원에 의한 불멸화 간세포주에서 T항원 비의존성 세포의 발생
Immortalized hepatocytes established with a temperature-sensitive SV40 T antigen could be independent of T antigen
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초록
목적 : 온도조건부 변이형 SV40 T항원으로 불멸화 된 세포는 허용온도(33℃)에서는 거의 무한정 증식이 가능하지만, 비허용온도(37～39℃)에서는 T항원이 불활성화 되면서 p53의 기능이 되살아나 아포토시스가 일어나는 T항원 의존성이 있다. 본 연구에서는 온도조건부 불멸화 간세포주를 39℃에서 지속 배양하여, T항원의 기능을 차단 시킨 상태에서 증식이 가능한 T항원 비의존성 세포군이 발생하는지를 확인하고, 그 기전을 알아보고자 하였다.방법 : SV40 T항원의 온도조건부 변이형 유전자인 tsA58을 포함한 레트로바이러스를 이용하여 확립한 온도조건부 불멸화 쥐간세포 WA1을 39℃에서 배양하여 아포토시스를 유발하였다. 3주 이상의 배양에서 생존이 가능하였던 W39B, W39C, W39J의 3개 세포주를 획득하였고, 이 세포주를 대상으로 허용온도 및 비허용온도에서 세포 형태, 증식, 아포토시스(terminal deoxynucleotydyl transferase를 이용한 면역형광법), T항원 및 p53 발현(Western blot), Telomerase 활성도(telomerase repeat amplification protocol) 및 T항원 유전자 서열(direct sequencing)에 대한 분석을 시행하였다.결과 : 상피 유래 세포 모양의 WA1은 허용온도에서 30.8±1.7시간마다 배가 증식하였으나, 비허용온도에서는 노화 및 아포토시스에 빠졌다. 그러나 T항원 비의존성 세포주들은 비허용온도에서도 세포 형태를 유지하면서 증식이 지속되었고, 아포토시스도 일어나지 않았다. 웨스턴블롯 결과, WA1에서 T항원은 허용온도에서 검출되었고 비허용온도에서는 검출되지 않았다. 이러한 T항원의 온도조건부 발현 양상은 T항원 비의존성 세포주에서도 그대로 유지되었다. 그러나 p53 단백발현 양상은 WA1에서는 온도조건부 발현 양상과 일치하였으나, T항원 비의존성 세포주에서는 비허용온도에서 지속적으로 검출되는 이상 소견을 보였다. 텔로머라제는 T항원 비의존성 세포주 모두에서 그대로 유지되어 있었다. 온도조건부 조절능을 나타내는 T항원 유전자 점변이(3505번의 G -> A)가 WA1에서 확인되었는데, 이 변이는 T항원 비의존성 세포주에서도 그대로 유지되어 있었다.결론 : 온도조건부 변이형 T항원에 의하여 불멸화 된 세포주는 계대배양이 지속될 때 T항원 의존성이 소실되면서 비허용온도에서도 증식이 가능한 세포가 발생할 수 있으며, 본 세포주에서 이러한 T항원 비의존성은 T항원 자체의 변이가 아닌 p53의 변화가 관여할 것으로 추정된다.
Abstract
Background : Conditionally immortalized hepatocytes (CIH) can be cultured almost indefinitely at permissive temperatures (33℃), but they undergo apoptosis at nonpermissive temperatures (37～39℃) by the release of p53 through inactivation of T antigen, which is called T antigen dependency. This study was aimed at examining if T antigen-independent clones can develop from CIH. Methods : CIH established with a temperature-sensitive T antigen (WA1) were cultured continuously at 39℃. Three clones (W39B, W39C, and W39J) survived at this temperature and was subject to following analyses: the morphology, growth, apoptosis, the expression of T antigen and p53, telomerase, and the T antigen gene sequence. Results : WA1 proliferated at 33℃ with the population doubling time of 30.8±1.7 hours, but they underwent cell death at 39℃. However, T antigen-independent clones (W39B, W39C, and W39C) proliferated at 39℃ without undergoing apoptosis, suggesting they lost the temperature-sensitive characteristics. WA1 expressed the T antigen at 33℃, but not at 39℃, and this temperature-sensitive pattern was maintained in T antigen-independent clones. In p53 expression, however, T antigen- independent clones revealed a different pattern. p53 was detected even at 39℃ where it normally would not be detected. Telomerase was activated in all the analyzed cell lines. A temperature- sensitive point mutation at nucleotide position 3505 of the WA1 was retained in all T antigen- independent clones. Conclusion : CIH can lost temperature-sensitive characteristics and acquire an ability to proliferate at nonpermissive temperatures. These changes might be related to the change of p53 rather than the change of T antigen itself in these cell lines.
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