구강 외 노출시간에 따른 흰쥐 치아 치주인대세포 활성도의 MTT 검색법을 이용한 평가
Evaluation of periodontal ligament cell viability on rat teeth according to various extra-oral dry storage times using MTT assay
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초록
구강 외 노출시간에 따른 흰쥐 치아 치주인대세포 활성도의 MTT 검색법을 이용한 평가399데 시행되는 치료법이다1). 이러한 술식들이 성공하기 위해서는 치아 발거나 탈구시 치주조직의 손상 정도와 발거된치아의 치근면상에 존재하는 치주인대세포의 건전성 및 활성도가 치료의 성패를 좌우하는 중요한 요인으로 작용하게된다2). 이러한 치주인대세포의 활성도를 실험적으로 평가하기 위해 여러 가지 방법이 제시되었다. Patil 등은3) 탈구된 치아의 치주인대 세포 활성도를 평가하는데 fluorescein diac-etate를 이용하여 염색한 후 광학 현미경과 혈구 계산판(hemocytometer)으로 직접 세어 활성도를 측정하였다.Hupp 등은4) 탈구된 치아의 잠재적인 치유 능력을 보다 명확히 밝혀내기 위해 세포의 표식자로서 radioactive DNAprecursor인 H3 thymidine을 치주인대세포에 부착시킨 후치아를 탈회시켜 시편을 관찰하여 활성도를 평가하였다.Lekic 등도5) 교정치료 목적으로 발치된 소구치의 치근막에서 치주인대세포를 채취하여 배양시켜 하나의 세포에서 형성된 군집 (colony)을 methylene blue 등으로 염색하여그 군집의 숫자를 세어 활성도를 평가하였다. 그리고Ashkenazi 등은6) trypsin과 collagenase를 이용하여 치근표면으로 부터 직접 치주인대세포를 채취하고 배양시켜 이를 다양한 저장 용액에 보관한 후 neutral red나 trypanblue 등으로 염색하여 치주인대 세포 활성도를 평가하였다. 그러나 이러한 모든 방법은 세포의 채취 과정에서 치근면의 모든 세포가 채취된다는 뚜렷한 증거가 없으며 또한 세포가 비록 살아 있다 하더라도 그 수의 약 70%만이 세포분열능력이 있어 실제 살아있는 치주 조직의 치유능력과는차이가 있을 수 있다4). 또한 이러한 방법들은 치근면에서채취된 세포를 배양한 것이므로 원래 채취된 세포와는 다른많은 변수가 작용할 수 있다. Tetrazolium-based colorimetric (MTT) 검색법은 많은시료를 간단히 빠르고 객관성 높게 판독할 수 있어 배양된세포에서 세포 독성에 관한 연구에 주로 사용된 이 방법은대사 과정이 온전한 세포의 미토콘드리아 내에 탈수소효소가 노란색 수용성 tetrazoliumsalt[3-(4,5-dimethylthia-zol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] (MTT) 를비수용성의 자주색 MTT formazan결정으로 환원시키는원리를 이용한 것으로 적절한 파장에서 microplate reader로 흡광도를 측정함으로써 대사적으로 왕성한 세포의 농도를 반영하게 되며 주로 in-vitro 실험에 사용되어져 왔는데만일 in-vivo 실험에서 치주인대의 활성도를 측정하는데 이용할 수 있다면 기존의 세포배양을 통한 실험보다는 훨씬더 정확한 결과를 기대할 수 있을 것이다7).Kim 등은8) 다양한 보관용액에서 시간 변화에 따른 치근면의 치주인대세포 활성도 평가에서 MTT 측정치 결과와조직학적 관찰 결과가 상당히 일치됨을 발견하고 MTT 검색법이 치주인대세포 활성도 평가에 유용한 한 방법이 될수 있음을 보고하였다. 이에 본 연구는 지금까지의 실험 결과를 토대로 MTT 검색법을 이용하여 흰쥐 상악 대구치를 발거 후 짧은 시간 (즉시, 10분, 20분, 40분, 60분)동안 실온에 노출시킨 다음치아를 MTT용액에 저장 후 치근면의 치주인대 세포 활성도를 microplate reader (BIO-RAD, AC, USA)로 흡광도 (Optical Density)를 측정함과 동시에 이를 냉동 절단법을 이용한 조직학적인 관찰 결과를 토대로 치주인대세포의 활성도 평가에 이용되는 MTT검색법의 유용성을 검증하고자 하였다.
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- "408구강 외 노출시간에 따른 흰쥐 치아 치주인대세포 활성도의 MTT 검색법을 이용한 평가전인수김의성김 진이승종*연세대학교 치과대학 치과보존학교실본 연구의 목적은 MTT 검색법을 이용하여 흰쥐 상악 대구치를 발거한 후 실온의 건조 상태에서의 시간 변화에 따른쥐 치아 치근면의 치주인대 세포 활성도를 측정함과 동시에 냉동 절단법을 이용한 조직학적인 관찰 결과를 토대로 하여MTT검색법이 유용한지를 검증하고자 하였다.생후 4주된 암컷 Sprague-Dawley계 흰쥐 80마리를 이용하여 β -APN 전처치 후 상악 제 1 & 2 대구치를 모두 발거하였다. 이들 치아를 즉시 혹은 10 60분 동안 실온에서 건조 시킨 후 치아 자체를 MTT용액에 저장한 다음 흡광도 측정을 이용한 정량적 분석과 동시에 냉동 절단법을 이용하여 조직을 관찰하였다. MTT 검색에 의한 흡광도 값에 있어 즉시 처치군과 10분 건조군 사이에는 통계학적인 유의차가 없었다 즉시 처치군 및 10분 건조군은 20분과 40분 및 60분 건조군과 비교시 통계학적인 유의차를 보였다", pp.0~05