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논문KCI 등재

실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 상대정량에서 표준곡선의 영향

Influence of Standard Curves on Relative Quantification using Real-time PCR

김태형|이미경
대한진단검사의학회 (Korean Society For Laboratory Medicine)|2004.10|Annals of Laboratory Medicine|제24권 제5호|pp. 327-333

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초록

배경 : Real-time PCR을 이용한 상대정량은 절대정량에 비하여 좀더 쉽고 신뢰성 있는 방법으로 생각되지만, 여전히 표준곡선의 조제와 보관 등에 따른 오류의 위험을 내포하고 있다. 이에 본연구에서는 유전자 표현을 위한 상대정량에서 대상 유전자와 기준유전자 정량을 위한 표준곡선의 영향을 평가하기 위하여, Candidaalbicans의 유전자 정량 시 표준곡선의 농도별 정밀도와 효율을 분석하고 표준곡선이 대상 유전자의 상대정량에 미치는 영향을 평가하여 보고자 하였다.방법 : 표준곡선의 정밀도는 대상 또는 기준 유전자에 대한 정제된 PCR 산물을 10배씩 연속적으로 희석하여(10-4-10-9) 검사중 변이계수(coefficient of variation, CV)와 검사 간변이계수를측정하여 평가하였다. 표준곡선의 영향을 평가하기 위하여 동일한cDNA를 사용하여 독립된 real-time PCR로부터 얻은 상대정량결과에서 10% 이상의 변이계수를 보인 10번의 반응결과와 변이계수가 10% 미만인 10번의 반응결과를 비교하여 보았다.결과 : Crossing point (Cp)값을 이용한ERG11과 ACT1에대한 검사 중 변이계수는 각 0.12-1.05%로 대부분 1% 이하로매우 낮은 결과를 보였고, ERG11, CDR1, MDR1 및 ACT1에대한 검사 간 변이계수는 2.07-6.84%로 대부분 5% 이하의 결과를 보였지만, 검사 중 변이계수에 비하여 높은 변이를 보였다. 또한 기준 유전자 또는 대상 유전자 표준곡선의 효율이 낮고 동시에 표준곡선의 효율차가 5% 이상인 경우는 상대정량 값에 영향을 줄 수 있을 것으로 판단되었다. 결론 : mRNA의 상대정량 시 real-time PCR 과정의 변이를 줄이기 위하여 각 검사실에서 실현 가능한 지침을 만들어 표준화하는 것이 중요하다고 사료되었다.

Abstract

Background : Although relative quantification by real-time PCR may be easier to perform than absolute quantification, there is a risk of errors associated with standard curve construction. The aim of this study was to evaluate the effects of standard curves on relative quantification using real-time PCR in Candida albicans. Methods : The reproducibility of real-time PCR-based standard curves for target genes and a reference gene generated from PCR amplicons (10-fold serial dilution, 10-4 to 10-9) was evaluated. In addition, the effects on standard curves were evaluated by running the same cDNA samples. Results : The within-run variation (CV) by crossing point (Cp) was 0.12-1.05% for ERG11 and ACT1, whereas the between-run CV was 2.07-6.84% for ERG11, CDR1, MDR1 (target gene) and ACT1 (reference gene). The differences in PCR efficiency between targets and reference may be attributable to variations in relative quantification. Conclusions : To achieve reliable relative quantification of mRNA in real-time PCR, a feasible guideline and standardization are of major importance. (Korean J Lab Med 2004; 24: 327-33)

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